Pot: Raziskovalna dejavnost | Adaptivna mutacija

Adaptivna mutacija

Moderna sinteza imenovana neodarvinizem danes predstavlja temelj znanstvenega razmišljanja v biologiji in vidi izvor mutacij v naključni inherentni nenatančnosti DNA podvojevanja ali kot posledico različnih naravno pojavljajočih poškodb dvojne vijačnice. Temelj takšnega razmišljanja so klasični poskusi, ki so jih izvedli raziskovalci v '40 letih prejšnjega stoletja, katerih rezultati dokazujejo, da mutacije lahko nastajajo neodvisno od selekcijskega pritiska. Najbolj znan je klasičen poskus, ki je preučeval pojavljanje mutacij v proteinu, na katerega se veže bakterijski virus (Luria in Delbruck 1943). Avtorja sta potrdila, da se mutacije pojavljajo v času rasti (rastno odvisne mutacije) in torej nastopijo pred stikom virusa in bakterijske celice.

Vezava virusa na membranski protein bakterije

Vendar klasični poskusi niso izključili obstoj mutacij, ki se pojavijo med selekcijo, saj je letalen stres (v tem primeru virus) ubil ali v celoti inhibiral rast bakterijskih celic. V času neletalnega in nemutagenega selekcijskega pritiska, na primer stradanja, pa v bakterijskih celicah nastajajo mutacije, ki sprostijo selekcijski pritisk in celici omogočijo rast (Cairns in sod. 1988). To so tako imenovane adaptivne mutacije, katerih izvor je bila osrednja tema disertacije.

Poskuse smo opravljali na celicah Escherichia coli K-12, ki imajo izbrisan encim lacZ ß-galaktozidazo, zato tihi ebg operon (glej spodnjo shemo) kodira edino ß-galaktozidazo v celici in ta učinkovito razgrajuje disaharid laktulozo. Izražanje encima je pod nadzorom EbgR represorja, zaradi njegove aktivnosti pa celice ne sintetizirajo zadostne količine Ebg ß -galaktozidaze.

Shema ebg operona: Ebg operon je lociran na 67'5 minuti genetske mape E. coli K- 12 in ima tipično hieararhično naravo, saj poleg zaporedij, ki kodirajo represor EbgR, obe podenoti ß-galaktozidaze in protein EbgB, vsebuje tudi mozaik vezalnih mest za ribosome (R), vezalno mesto za represor ali tako imenovani operator (O), promotor, ki ga prepozna sigma faktor RNA polimeraze ( -35 in -10 konsenzusno zaporedje) ter vezalno mesto za cAMP receptorski protein ali CAP mesto (Hall in sod. 1989). Mesto T je transkripcijski teminator represorja, števila pod/nad elementi pa predstavljajo pozicijo znotraj ebg operona izraženo v baznih parih.

Na minimalnem gojišču z laktulozo kot edinim virom energije in ogljika se zato celice ne delijo oziroma se delijo zelo počasi. Celica tvori kolonijo le v primeru, če mutacija prekine sintezo ali učinkovitost represorja EbgR, kar omogoči sintezo zadostne količine ß -galaktozidaze. Ko je Hall (1999) celice nanesel na minimalno gojišče z laktulozo kot edinim virom ogljika in energije je ugotovil, da so adaptivne mutacije v genu ebgR v 80% uravnane z najmanjšimi avtonomnimi mobilnimi genetskimi elementi imenovanimi insercijska zaporedja. Preostale mutacije znotraj ebg operona pa so lokalne spremembe nukleotidnega zaporedja, ki na različne načine omogočajo zadostno sintezo Ebg ß-galaktozidaze.

Metodo, s katero smo ločili mutante, ki nastanejo kot neposreden odgovor na selekcijski pritisk ali adaptivne mutante ter mutante, ki vzniknejo neodvisno od selekcije ali rastno odvisne mutante imenujemo fluktuacijski test. Fluktuacijski test, v celoti je povzet po Hall-u (1998, 1999), smo začeli z neodvisnimi bakterijskimi kulturami, ki smo jih vzgojili iz 2000-3000 genetsko identičnih celic med katerimi ni mutant. Z definirano koncentracijo glicerola smo jim v 24 urah omogočili rast do približno 19 milijonov celic. Neodvisno bakterijsko kulturo smo potem razmazali na selekcijsko gojišče z laktulozo kot edinim virom ogljika in energije, gojišča inkubirali na 30°C ter vsak dan prešteli prirastek mutant. Prve vidne kolonije se pojavijo po treh dneh in so posledica rastno odvisnih mutacij, ki se zgodijo v času priprave bakterijske kulture. Kolonije, ki pa jih opazimo na četrti dan in v naslednjih dneh ali tednih inkubacije, pa so posledica mutacij na selekcijskem gojišču z laktulozo in jih jemljemo kot adaptivne mutante.

Naš namen je bilo ugotoviti ali lahko magnezij iz okolja z vplivom na celično komunikacijsko mrežo spreminja frekvenco adaptivnih mutacij v ebg operonu. Poleg različnih koncentracij magnezija smo s tehnologijo ELIBRA v gojišče vnesli tudi vibracijo izbranega iona. Tehnologija je razvita na Inštitutu Bion in omogoča, da vsak ion ali kristal (vir vibracije) s pomočjo elektrike vtisnemo v sterilno destilirano vodo (prejemnik vibracije) (Jerman in sod. 2005). Z uporabo te tako imenovane informirane vode smo v minimalno mineralno gojišče vnesli vibracijo izbranega iona. Zelo temeljito smo preverili predvsem vpliv magnezijevih ionov, saj adaptivna mutacija ebg operona potrebuje funkcionalen dvokomponentni regulatorni sistem PhoPQ (Hall 1998), za katerega predstavlja magnezij primaren signal (Garcia-Vescovi in sod. 1996).

Ugotovili smo, da prisotnost presežnih Mg ionov v gojišču (vir MgSO4) značilno znižuje frekvenco adaptivne mutacije. Če pa smo v gojišče dodali zgolj vibracijo Mg in torej presežnih ionov magnezija v gojišču ni bilo, smo prav tako zaznali značilen padec frekvence (Krašovec in sod. 2005). To lepo prikazuje spodnji grafikon.

Glede na številne kontrolne poskuse ki smo jih izvedli menimo, da je opazovana porazdelitev adaptivnih mutant v treh različnih okoljih realen pojav, ki zasluži znanstveno razlago. Rezultati kažejo, da prisotnost magnezija v okolju vpliva na frekvenco adaptivne mutacije posredno, torej kot signalna molekula (Krašovec 2005). Iz tega sledi, da so šele celične komponente, ki sodelujejo v mehanizmu zaznavanja magnezija ali so od njega posredno ali neposredno odvisne, tiste, ki v reorganizaciji ebg operona sodelujejo direktno, torej vplivajo na transpozazo ali kar direktno na insercijsko zaporedje. Temu sledi sinteza Ebg ß-galaktozidaze, delitev in tvorba kolonije. Katere so te komponente bodo pokazali poskusi v prihodnosti.

Predstavljeni rezultati so povsem v skladu s spoznanjem zadnjega desetletja, da je bakterijska celica komunikativen in kooperativen organizem, z globalno integrirano mrežo za zaznavanje in procesiranje številnih molekulskih in fizikalnih signalov, kar ji zagotavlja rast, gibanje, diferenciacijo, razmnoževanje in adaptacijo na številne razmere v okolju. Komunikacijska mreža tako celici omogoča prepoznavanje različnih kombinacij okoliških signalov, kar povečuje raznolikost njenih odzivov, stabilizira odgovor na posamezen signal ter omogoča enostaven razvoj novih odgovorov na okolje. Predstavljeni rezultati so prav tako v skladu z najnovejšimi ugotovitvami, ki kažejo genom kot dinamičen hierarhično in modularno organiziran sistem namenjen procesiranju ter shranjevanju informacij. Genom prokariontov in evkariontov je namreč fleksibilen shranjevalen medij celice, ki mora biti dinamično dostopen, podvojen, popravljen, spakiran, prenesen in reorganiziran, če je to potrebno. Vendar je genom sam po sebi inerten. Informacije znotraj genoma se shranjujejo, berejo in spreminjajo le s funkcionalnim izražanjem ostalih celičnih informacijskih sistemov, ki interagirajo z DNA molekulo. V največji meri so ti sistemi grajeni s proteini, dostopnost informacij znotraj genoma pa celice regulirajo tudi s spreminjanjem lokacije in topologije genoma. Ti celični sistemi pa so lahko odgovorni tako za lokalne kot tudi za globalne spremembe genoma, med katere sodi tudi adaptivna mutacija.

Adaptivno mutacijo je torej treba gledati bolj kot splošno celično strategijo, da s pomočjo dostopnih celičnih funkcij spreminja lasten genom. Zaradi mnoštva mehanizmov, ki omogočajo adaptivno mutacijo, ne samo v različnih sevih in taksonih, ampak že v eni sami posamezni celici, pa je malo verjetno, da so se sistemi za spreminjanje genoma razvili zgolj za namen produkcije genetske variabilnosti, ki je nato substrat za naravno selekcijo. Adaptivna mutacija je v celici zgolj ena od akcij, ki se dogajajo v času njenega življenja in je torej lahko podvržena enaki stopnji nadzora in regulacije, kot so jih deležne ostale celične akcije. Poudarjamo besedo lahko, saj mutacije nastopijo tudi popolnoma neodvisno od celičnih nadzornih in regulatornih sistemov. Nesrečni dogodki, ki so lahko posledica sevanja, kemikalij, oksidativnih poškodb, kemijske nestabilnosti DNA molekule ali zaradi neobhodnih napak pri podvojevanju so neizpodbitno znanstveno dejstvo, vendar kot kaže danes so le ena plat zgodbe. Regulacija vstavitve insercijskih zaporedij, ki smo ji priča v adaptivni mutaciji ebg operona, morda predstavlja starodaven mehanizem prokariontov, da aktivirajo tihe gene, ko jih najbolj potrebujejo in jih potem zopet utišajo, ko jih ne potrebujejo več (Koch 2004). Po našem mnenju so naši rezultati in rezultati številnih drugih študij dokaz, da ni prav smotrno vedno znova jemati koncept sebičnosti kot podlago za interpretacijo eksperimentalnih rezultatov povezanih z mobilnimi genetskimi elementi.

Navkljub neujemanju naših in mnogih drugih rezultatov s postulati neodarvinizma poudarjamo, da ne naši, ne katerikoli drugi rezultati ne bi smeli obujati ideje o usmerjeni mutaciji. Signal iz okolja ne usmerja mutacijo na določen del genoma v nekem izvornem lamarkističnem smislu. Adaptivna mutacija je posledica stohastičnih zaporednih ali vzporedno razpršenih molekulskih akcij, ki so v tistem trenutku možne, za njih pa so odgovorni različni celični sistemi, med katere sodi tudi komunikacijska mreža. Po našem mnenju je torej proces, ki ga signal sproži, le 'navidezno' adaptiven, izid tega procesa, adaptivna mutacija v ebgR genu da ali ne, pa je zgolj naravna posledica izvajanja tega procesa. Bakterijska celica torej nikakor ne planira mutacij v ebgR genu, ampak je njena narava tista, ki tak pojav sploh dopušča in hkrati tudi izvede. Nastanek nove genetske informacije je v tem primeru povezan z nič selekcije, saj je izvor adaptivne mutacije v tesni povezavi s poznavanjem narave celične dinamične organizacije, ki pa očitno ne ustreza sodobnim molekulsko - redukcionističnim predstavam.

Literatura:

Cairns J., Overbaugh J., Miller S. 1988. The origin of mutants. Nature; 335: 142-145.

Hall B.G. 1998. Adaptive Mutagenesis at ebgR is regulated by PhoPQ. Journal of Bacteriology, 180: 2862-2865.

Hall B.G. 1999. Spectra of spontaneous growth-dependent and adaptive mutations at ebgR. Journal of Bacteriology, 181: 1149-1155.

Hall B.G., Betts P.W., Wootton J.C. 1989. DNA sequence analysis of artificially evolved ebg enzyme and ebg repressor genes. Genetics, 123: 635-648.

Garcia Vescovi E., Soncini F.C., Groisman E.A. 1996. Mg as an extracellular signal: environmental regulation of Salmonella virulence. Cell, 84: 165-174.

Koch A.L. 2004. Catastrophe and what to do about it if you are a bacterium: The importance of frameshift mutants. Critical Reviews in Microbiology, 30: 1-6.

Luria S.E., Delbrück M. 1943. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics, 28: 491-511.

Naša literatura:

Krašovec, R., Jerman, I., Jan, L. 2010. Growth-dependent and adaptive mutation rates to ebgR and IS30 transposition in the bacteria Escherichia coli K-12 at different extracellular Mg2+ concentrations. Acta Biologica Slovenica, 53: 69-80.

Jerman J., Krašovec R., Leskovar R.T. 2009. Deep significance of the field concept in contemporary biomedical sciences. Electromagn. Biol. Med. 2009; 8(1):61-70.

Jerman I., R. Ružič, R. Krašovec, M. Škarja, and L. Mogilnicki. 2005. Electrical transfer of molecule information into water, its storage and bioeffects on plants and bacteria. Electromagnetic Biology and Medicine, 24: 341-353.

Krašovec R., Jerman I., Škarja M. 2005. Electromagnetic information imprinted into medium act as environmental signal for bacteria Escherichia coli. In: Coherence and Electromagnetic fields in Biological Systems, In: Coherence and Electromagnetic fields in Biological Systems, July 1-4, (ed.) Pokorny J. Czech Republic. Institute of Radio Engineering and Electronics, Prague, pp. 146-148

Krašovec R. 2005. Adaptivna mutacija pri bakteriji Escherichia coli kot biološka funkcija. Doktorska disertacija, Ljubljana, 190 str.

Krašovec R., Jerman I. 2003. Bacterial multicellularity as a possible source of antibiotic resistance. Medical Hypotheses; 60(4): 484-488.

Krašovec R., Jerman I. 2002. Adaptive mutation: shall we survive bacterial genetic skills? Acta Biologica Slovenica; 45(2): 15-24.

Krašovec R. & Jerman I. Is a sort of intelligence at work in bacteria?, Zbornik C5. mednarodne multi-konference Informacijska družba, Kognitivne znanosti (ed.) Repov� G., Gams M. & Detela A., Ljubljana, 58-60, 2002.

Nazaj