|
Adaptivna mutacija
Povzetek
Študija odpornosti Escherichia coli na fag T1 je pokazala, da so mutacije lahko rezultat redkih spontanih dogodkov v času rasti, ki se zgodijo pred izpostavitvijo fagom. V 90. letih so temu klasičnemu spoznanju dodali enakovreden uvid, da v času neletalnega in nemutagenega selekcijskega pritiska v bakterijskih celicah nastajajo t.im. adaptivne mutacije, ki sprostijo selekcijski pritisk in celici omogočijo rast. Adaptivne mutacije se za razliko od rastno odvisnih mutacij pojavljajo samo v navzočnosti selekcije za te mutacije in ne v drugih ne-specifičnih oblikah stresa.
Poskuse smo izvajali na treh sevih Escherichia coli K-12, ki imajo nefunkcionalen gen za LacZ ß-galaktozidazo, zato tih ali kriptičen ebg operon kodira edino ß-galaktozidazo v celici. Celice zaradi aktivnega represorja EbgR ne sintetizirajo zadostne količine Ebg ß-galaktozidaze, zato se na minimalnem gojišču z laktulozo, kot edinim virom ogljika in energije ne delijo oziroma se delijo zelo počasi. Celice tako vstopijo v stacionarno fazo ter tvorijo kolonijo le v primeru, če so sinteza, aktivnost ali učinkovitost represorja EbgR znižane. Fluktuacijski testi so nedvoumno pokazali, da se na selekcijskem gojišču z laktulozo več tednov pojavljajo adaptivne mutante, ki imajo prekinjen gen ebgR. To omogoči RNA-polimerazi prepisovanje ebg operona in tako nastane zadostna količina Ebg ß-galaktozidaze za rast in delitev.
Adaptivna mutacija v ebgR je v 80% uravnana z insercijskimi sekvencami. Vse kaže, da je insercija IS30 elementa v času stradanja vsaj delno usmerjena s še neznanimi dejavniki okolja. IS30 ima namreč naravno vročo točko, konsenzusno zaporedje dolgo 24 baznih parov, znotraj ebgR gena, ki pa je aktivna zgolj v času stradanja in ne v času rasti. Na adaptivno mutacijo vpliva tudi PhoP-PhoQ sistem, ki je sestavni del integrirane gensko regulatorne mreže. Ali drugače, PhoP-PhoQ sistem ne deluje povsem avtonomno, ampak interagira z drugimi dvokomponentnimi regulatornimi sistemi, kot so EvgA-EvgS in BasS-BasR idr. Primarni signal za senzorni protein PhoQ je določena koncentracija Mg2+ v periplazmi. V milimolarni koncentraciji magnezija se phoQ in phoP izražata konstitutivno, v mikromolarni koncentraciji pa jima izražanje močno naraste. PhoP-PhoQ celicam E. coli predvsem omogoča rast v nizki koncentraciji Mg2+, saj PhoP med drugim aktivira proteina MgtA in MgtB, ki magnezij učinkovito transportirata v celico.
V raziskavi je bil naš glavni namen identifikacija faktorjev, ki vplivajo na proces adaptivne mutacije. Še posebej smo želeli ugotoviti, ali je IS30 element podvržen regulaciji s strani elementov gensko regulatorne mreže. Na ta način bi ugotovili, ali je adaptivna mutacija reguliran stresni odgovor povsem ekvivalenten na primer odzivu na težavne razmere idr. Hkrati bi lahko ponovno potrdili, da insercijske sekvence oz. na splošno mobilni genetski elementi kljub navidezni samostojnosti niso povsem avtonomni in ťsebičniŤ genetski elementi. S pomočjo fluktuacijskih testov in genetskimi analizami smo preverjali hipotezo, da ima Mg2+ pomembno vlogo v procesu adaptivne mutacije ebg operona.
Primerjali smo stopnjo adaptivnih mutacij na selektivnem gojišču z laktulozo v okolju z različnimi koncentracijami Mg2+. Kot referenčno vrednost smo uporabili 400ľM MgSO4, okolje z visoko koncentracijo Mg2+ je vsebovalo 5mM MgSO4, okolja z nizko koncentracijo Mg2+ pa 50 ľM, 4 ľM in 0.4 ľM MgSO4. Pri celicah divjega tipa nismo odkrili jasne povezave med izražanjem PhoP-PhoQ in stopnjo adaptivnih mutacij v ebgR genu. Pri phoP in phoQ mutantah pa stopnja adaptivnih mutacij v referenčnem okolju značilno pade, v okolju s 5 mM magnezijem pa se število adaptivnih mutant poveča. Pri phoQ mutantah stopnja adaptivnih mutacij doseže skoraj enako stopnjo kot pri celicah divjega tipa, drugače je pri phoP mutantah, kjer je število adaptivnih mutacij značilno nižje od phoQ mutant. Magnezij ne vpliva na stopnjo rastno odvisnih mutant v celicah z okvarjenim PhoQ proteinom. Ugotavljamo tudi, da magnezij v divjem sevu ne vpliva na frekvenco transpozicije IS30.
Vse skupaj kaže, da bi lahko bil znotrajcelični Mg2+ ključni faktor za proces adaptivne mutacije v ebgR genu. Pred nami sta dve hipotezi. Prva pravi, da magnezij zgolj omogoči adaptivni mutanti, da naredi kolonijo, kar bi pomenilo, da je adaptivna mutacija per se proces neodvisen od magnezija. Druga pa predpostavlja, da magnezij preko vpliva na gensko regulatorne elemente ali insercijska zaporedja, ki sodelujejo v procesu adaptivne mutacije, posredno spreminja število mutacijskih dogodkov. Le novi poskusi lahko prinesejo dodatna spoznanja o adaptivni mutaciji, katere izvor je še vedno skrajno slabo razumljen.
Nazaj
|
